<button id="rrd2y"><acronym id="rrd2y"></acronym></button>

  • <strong id="rrd2y"><track id="rrd2y"></track></strong>
  • 您當前的位置:檢測資訊 > 科研開發

    HPLC有關物質方法優化的六大要素

    嘉峪檢測網        2024-05-29 11:14

    在眾多分析方法中,高效液相色譜法因具有適用范圍廣、操作簡便的優點,已成為有關物質測定最常用的方法。因此本文以高效液相色譜法方法開發為例,對有關物質分析方法建立及優化的關鍵點,進行討論,與大家分享。

     

    Step1  分析對象確定

    在接到一個有關物質分析方法開發的任務時,首先要對反應線路和工藝進行了解,并與合成研究員共同探討可能的工藝雜質和降解雜質,目的是要確認在所要開發的方法中,需要考慮的雜質有哪些?哪些雜質是需要重點考察(需達一定的線性、精密度、準確度),哪些雜質僅需滿足分離度要求即可,在方法開發之前需要對這些信息有大致的判斷。

     

    Step 2  理化性質研究

    在確認了需要控制的雜質后,要對 API 的理化性質進行研究,例如解離常數對流動相 pH 設置有提示作用;分配系數可以對分析系統和保留時間有預判;結構中是否存在共軛結構等有助于檢測器類型的選擇。

     

    Step 3 分析系統選擇

    分析系統的選擇取決于 2 方面,一是待分析化合物的極性特征,二是所選擇色譜柱填料的類型。絕大多數情況下,都可以采用反相液相進行。當待測化合物極性較大且通過調整有機相比例、添加離子對試劑或者更換 Hilic 色譜柱都無法得到較好的分離效果時可以考慮正相色譜法,另外如果需要分析異構體雜質,并且所選擇的手性柱為正相填料,那么也應該選擇正相色譜法。

     

    Step 4  初始方法建立

    在分析系統確定后,就可以建立初始分析方法了。首選有機相與水作為流動相,采用最簡單的勻速線性梯度,考察主峰及各雜質的分布情況,對方法有機相的初始和終點比例有大致的判斷,同時對樣品進行多波長掃描,選擇可以同時兼顧主成分和雜質分析的波長。如果在有機相和水作為流動相時化合物峰型極差可以考慮將水更換為酸溶液或緩沖鹽。

     

    Step 5  方法優化

    通常初始方法的性能不能達到我們所設定的要求,需要繼續進行優化,主要是優化分離度。分離度計算公式為:

    通過公式可知,分離度是理論塔板數、選擇性和保留因子的公式,凡是能影響理論塔板數、選擇性和保留因子的因素都是方法優化的對象,包括色譜柱、流動相種類、 pH 、添加劑種類和濃度、流動相梯度、柱溫等。

    一般情況下,首先優化無法量化的色譜柱和流動相種類,然后再對流動相 pH 、添加劑種類與濃度、流動相梯度、柱溫等條件進行優化。

    5.1  色譜柱

    1 )色譜柱是液相系統的核心,更換色譜柱填料類型(圖 2 )對分離度產生的影響是最大的。

    反相色譜柱常用的填料包括 C18 、 C8 、 C4 、氨基柱、苯基柱等,正相色譜柱常用的填料包括多糖或淀粉鍵合柱,氨基柱等。填料選擇取決于待分析化合物的極性特征以及是否含有特定基團,例如非極性及弱極性化合物適用于 C18  色譜柱,中等極性化合物可使用氨基柱,極性化合物可嘗試 Hilic 色譜柱或正相色譜柱,芳香族化合物可以嘗試苯基柱。

    除了填料類型,碳載量和比表面積也是影響保留的重要因素,碳載量高的色譜柱保留強,如果篩選填料類型后分離仍不理想可以考慮嘗試碳載量更高的色譜柱,也許會有較好的效果。

    在色譜柱篩選時應關注不同批次填料的差異,這將影響常規測樣期間更換色譜柱后檢測結果的重現性,嚴重時甚至可能會導致方法終止。

    圖2 色譜柱填料類型

    2 )色譜柱粒徑和內徑越小峰型越尖銳,容易獲得更好的分離度,但同時色譜柱背壓也會越高,在選擇這些參數時要考慮儀器的壓力耐受范圍。

    3 )柱長與分離度成正比,色譜柱越長,獲得的理論塔板數越高,分離越好,但待分析物保留時間會相應增加,分析時間可能會延長。

    5.2  溶劑種類

    溶劑類型會影響選擇性。反相色譜中常用的有機相為乙腈、甲醇,有時也會加入適量的 THF 以增加選擇性,添加量一般不超過 10% ,否則可能會耗損液相色譜儀。其中乙腈的洗脫能力更強,且截止波長短,粘度低,惰性好,是有機相的首選。甲醇與乙腈洗脫能力不同,與待測組分及固定相的相互作用方式也不同,因此待測組分在甲醇中與在乙腈中可能呈現不同的洗脫順序或分離效果,必要時可以將乙腈 - 甲醇以一定比例混合作為有機相。

    5.3  流動相 pH

    目前大多數藥物具有可電離基團,流動相 pH 可明顯影響待分析化合物及相關雜質的解離狀態,酸性化合物在酸性條件下具有更好的峰型和保留,堿性化合物在堿性條件下具有更好的峰型和保留,在 pH 優化過程中除了要考慮待分析物的結構特征外,要重點關注色譜柱所能耐受的使用范圍,大多數色譜柱填料都是硅膠基質的,即便鍵合了惰性基團,堿性條件下也很容易溶解,因此使用高 pH 時一定要做詳細的技術咨詢。

    5.4  流動相添加劑種類及濃度

    1 )流動相添加劑種類包括酸和緩沖鹽,采用哪種添加劑需要通過試驗結果來選擇,通常情況下緩沖鹽使用更普遍。

    2 )添加劑濃度可能影響待測組分的峰型和保留,一般從低濃度開始,逐步增加濃度,當峰型和分離不再改善時停止優化,以獲得可接受分離效果所需的最低濃度作為添加劑濃度。

    5.5  梯度

    流動相梯度變化可改變溶劑強度,是改善分離的重要手段。梯度設置可依據樣品中雜質分布情況來調節,通常分布密集的地方可以采用更低的變化速率,雜質稀疏的地方可以采用更快的變化速率,但也需要注意由于不同組分對有機相變化的敏感程度不同,也不是一味降低梯度變化速率就能獲得更好分離,有時可能獲得相反的結果。建議在梯度篩選的開始時多設置不同的變化速率,整體考察各待測組分對梯度的敏感程度,總結出規律,再有針對性的設置梯度。

    5.6  柱溫

    隨著液相色譜的普及,柱溫作為改善分離的輔助手段的重要性越來越受到重視。柱溫通過兩種方式影響分離度,一是高溫可使峰型更尖銳,從而改善分離度;二是高溫可使各待測組分保留時間提前,且不同的組分對溫度敏感程度不一樣(有研究表明溫度對可電離化合物的影響高于不可電離化合物),從而改變分離度,但是分離度可能變好也可能變更差,需通過試驗數據進行確認。此外,由于高柱溫可使保留時間更短,提高分離速度,因此可以縮短分析時間,提高工作效率。

     

    Step 6  方法預驗證

    分析方法開發完成后,需要對所開發的方法進行簡單的預驗證,以便為后續方法學驗證提供一個較好的輸入。一般情況下可以對專屬性(降解試驗)、定量限、檢測限、回收率、溶液穩定性等做初步考察,同時結合方法開發過程中對方法特性的理解,對可能影響方法性能的條件進行適當的耐用性考察。

     

    結束語

    有關物質方法開發的總體原則是在保證專屬性、靈敏度、準確度等必要條件下,盡量縮短分析時間,以提高檢測速率,同時實現方法的經濟性。

    方法開發是在工藝未完全確認的階段開展的,當工藝發生變更時要仔細評估,隨時調整方法,確保方法能適用于雜質譜研究,為后續安全性評價奠定基礎。

    分析方法開發沒有絕對的終點,是否終止開發取決于方法目標的設定,能達到設定的目標即可,無需花費更多的時間尋找更優的方法,因為當你這樣做的時候你會發現方法開發的工作將永遠無法結束,所以不要戀戰。

    一旦分析方法建立并經過驗證,就要建立基于風險評估和可用數據的控制策略,并在日常檢樣中持續監控方法性能,必要時進行方法改進。

     

     
    分享到:

    來源:Internet

    天天躁日日躁狠狠躁欧美老妇AP_日本四级视频网站_国产精品女人视频免费_日本中文字幕乱码在线高清
    <button id="rrd2y"><acronym id="rrd2y"></acronym></button>

  • <strong id="rrd2y"><track id="rrd2y"></track></strong>